ATP6H Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411234-ACT

ATP6V0E1 codifica ATP6H, una componente essenziale del dominio V0 della H⁺-ATPasi vacuolare (V-ATPasi), che guida la traslocazione di protoni necessaria all’acidificazione di endosomi, lisosomi e vescicole secretorie. Controllando il pH degli organelli, l’attività della V-ATPasi regola l’endocitosi mediata da recettore, lo smistamento e la degradazione delle proteine, il flusso autofagico e il traffico di membrana collegato a mTOR e alla segnalazione dipendente dai lisosomi. L’alterazione delle subunità della V-ATPasi compromette l’omeostasi vescicolare e può modificare la processazione degli antigeni, il caricamento dei neurotrasmettitori e il metabolismo cellulare. Una acidificazione vescicolare e una funzione lisosomiale disregolate sono implicate nell’adattamento delle cellule tumorali, in fenotipi neurodegenerativi e nella disfunzione immunitaria, rendendo ATP6V0E1 un nodo utile per lo studio delle vie endolisosomiali.

ATP6V0E1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATP6V0E1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATP6V0E1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATP6V0E1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATP6V0E1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATP6V0E1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATP6V0E1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATP6V0E1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATP6V0E1 nelle cellule tumorali con espressione di ATP6V0E1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.