Atg4b Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404173-ACT

L’ATG4B umano codifica Atg4b, una proteasi a cisteina che catalizza la processazione e la delipidazione delle proteine della famiglia ATG8, come LC3 e GABARAP, consentendone la coniugazione alla fosfatidiletanolammina e il loro riciclo dalle membrane autofagosomiali. Attraverso queste attività, Atg4b regola la biogenesi e la maturazione degli autofagosomi, nonché il flusso del carico sia nella macroautofagia sia nelle vie di autofagia selettiva. La funzione di ATG4B influenza la proteostasi, il controllo qualità di mitocondri e altri organelli e le risposte cellulari allo stress da carenza di nutrienti e all’ipossia. Un’autofagia dipendente da ATG4B deregolata è stata implicata in contesti rilevanti per la biologia del cancro, la neurodegenerazione e le infezioni, in cui l’alterato turnover di aggregati proteici e organelli danneggiati può rimodellare la sopravvivenza cellulare e la segnalazione infiammatoria.

Atg4b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATG4B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg4b Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATG4B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATG4B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg4b. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATG4B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg4b nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg4b nelle cellule tumorali con espressione di ATG4B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.