Atg14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402883-ACT

L’ATG14 umano codifica Atg14, un componente fondamentale del complesso I della fosfatidilinositolo 3-chinasi di classe III (PI3KC3), che promuove la produzione di fosfatidilinositolo 3-fosfato sulle membrane autofagosomiali nascenti. Atg14 contribuisce a specificare l’avvio dell’autofagia indirizzando il complesso Beclin 1–VPS34 verso il reticolo endoplasmatico e i siti di assemblaggio del fagoforo, sostenendo la nucleazione e la maturazione dell’autofagosoma. Attraverso il controllo del flusso autofagico e delle vie di degradazione selettiva, ATG14 influenza la proteostasi, il controllo qualità degli organelli e le risposte cellulari allo stress da carenza di nutrienti. Un’autofagia deregolata che coinvolge ATG14 è stata associata a meccanismi rilevanti per la biologia del cancro, la neurodegenerazione e la segnalazione infiammatoria, rendendolo un utile bersaglio per l’analisi delle vie di segnalazione.

Atg14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATG14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Atg14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATG14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATG14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Atg14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATG14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Atg14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Atg14 nelle cellule tumorali con espressione di ATG14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.