ATE1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405539-ACT

ATE1 codifica l’arginiltransferasi 1, un enzima chiave della via dell’N-degron (regola dell’N-end) che catalizza l’arginilazione post-traduzionale delle proteine per generare degron riconosciuti dalle ligasi dell’ubiquitina. Attraverso la regolazione del turnover mediato dal sistema ubiquitina–proteasoma, ATE1 influenza l’omeostasi proteica, l’organizzazione del citoscheletro, la migrazione cellulare e la segnalazione adattativa allo stress. L’arginilazione dipendente da ATE1 è stata inoltre collegata al controllo di qualità delle proteine mal ripiegate e alla modulazione delle reti di proteostasi. La disregolazione della segnalazione N-degron e le alterazioni della dinamica di degradazione proteica che coinvolgono ATE1 sono studiate in contesti quali il comportamento delle cellule tumorali e lo stress proteotossico associato alla neurodegenerazione.

ATE1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATE1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATE1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATE1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATE1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATE1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATE1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATE1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATE1 nelle cellule tumorali con espressione di ATE1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.