ASAHL Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407543-ACT

Il gene umano **NAAA** codifica per l’amidasi acida delle N-aciletanolammine (**ASAHL**), un enzima lisosomiale che idrolizza le etanolammidi degli acidi grassi, come la palmitoiletanolamide, nei corrispondenti acidi grassi ed etanolammina. Controllando i pool intracellulari di N-aciletanolammine bioattive, ASAHL influenza reti di segnalazione lipidica che si intersecano con la regolazione dell’infiammazione, le risposte allo stress cellulare e la funzione delle cellule immunitarie. L’attività di NAAA/ASAHL viene comunemente studiata nel contesto della neuroinfiammazione, della biologia del dolore e dell’infiammazione metabolica, dove un turnover alterato dei mediatori lipidici può spostare il “tono” delle vie di segnalazione senza modificare la biosintesi a monte. Il suo ruolo associato ai lisosomi la rende inoltre rilevante per investigare l’omeostasi degli organelli e il catabolismo lipidico in modelli cellulari rilevanti per la patologia.

ASAHL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NAAA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASAHL Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NAAA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NAAA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASAHL. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NAAA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASAHL nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASAHL nelle cellule tumorali con espressione di NAAA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.