Arnt 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401039-ACT

ARNT umano (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator; HIF-1β) codifica un fattore di trascrizione bHLH-PAS che forma eterodimeri con partner come AHR e HIF-1α/HIF-2α per coordinare programmi di espressione genica dipendenti dallo stimolo. I complessi contenenti ARNT regolano la segnalazione della risposta agli xenobiotici, l’adattamento cellulare all’ipossia, reti trascrizionali angiogeniche e metaboliche e, più in generale, vie di risposta allo stress che influenzano proliferazione e differenziamento. Per questi ruoli, ARNT è spesso studiato in contesti che collegano le esposizioni ambientali alla riprogrammazione trascrizionale e in modelli rilevanti per la malattia in cui la segnalazione dell’ipossia e l’attività della via AHR contribuiscono ad alterazioni dello stato cellulare e dell’espressione genica. La sua posizione centrale nei circuiti trascrizionali della famiglia PAS rende ARNT un nodo utile per analizzare il cross-talk tra vie e i meccanismi di controllo trascrizionale.

Arnt 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARNT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Arnt 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARNT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARNT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Arnt 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARNT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Arnt 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Arnt 1 nelle cellule tumorali con espressione di ARNT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.