ARK-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401568-ACT

AURKA codifica la chinasi serina/treonina ARK-1 (umana), un regolatore associato al centrosoma essenziale per l’ingresso in mitosi, la maturazione del centrosoma e l’assemblaggio del fuso bipolare. ARK-1 coordina la progressione del ciclo cellulare tramite la fosforilazione di substrati associati al fuso e ai microtubuli e si integra con il controllo del checkpoint mitotico per garantire una corretta segregazione dei cromosomi. Un’attività deregolata di AURKA compromette la stabilità genomica ed è frequentemente collegata a fenotipi proliferativi e all’aneuploidia osservati in ambito tumorale. In quanto nodo centrale della segnalazione legata alla mitosi, AURKA viene comunemente impiegato per indagare i meccanismi di amplificazione dei centrosomi, la dinamica del fuso e le risposte allo stress durante la divisione cellulare.

ARK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AURKA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARK-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AURKA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AURKA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARK-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AURKA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARK-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARK-1 nelle cellule tumorali con espressione di AURKA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.