apolipoprotein E/apoE Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400860-ACT

APOE codifica l’apolipoproteina E (apoE), una proteina secreta legante i lipidi che media il trasporto di colesterolo e trigliceridi attraverso interazioni con membri della famiglia del recettore LDL e con i proteoglicani eparan-solfato. ApoE è fondamentale per l’assemblaggio e la rimozione delle particelle lipoproteiche e influenza l’assorbimento cellulare dei lipidi, la loro ridistribuzione e i segnali di omeostasi in epatociti, macrofagi e cellule gliali. Nel sistema nervoso, apoE modula il mantenimento sinaptico, le risposte neuroinfiammatorie e le vie della proteostasi che incidono sulla gestione della β-amiloide. Differenze genetiche e di espressione in APOE sono fortemente associate a dislipidemia e neurodegenerazione, rendendolo un bersaglio chiave per studi meccanicistici del metabolismo lipidico e del crosstalk immuno-lipidico nel cervello.

apolipoprotein E/apoE Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APOE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

apolipoprotein E/apoE Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APOE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APOE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di apolipoprotein E/apoE. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APOE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da apolipoprotein E/apoE nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via apolipoprotein E/apoE nelle cellule tumorali con espressione di APOE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.