AMPK alpha 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-430618-ACT-2

Nel topo, Prkaa1 codifica la subunità catalitica α1 della proteina chinasi attivata da AMP (AMPKα1), un sensore energetico centrale che viene attivato dall’aumento dei livelli di AMP/ADP per ristabilire l’omeostasi dell’ATP. AMPKα1 integra segnali a monte provenienti da LKB1 e CaMKK2 e regola vie metaboliche che includono l’ossidazione degli acidi grassi, l’assorbimento di glucosio e l’inibizione dei programmi anabolici tramite bersagli quali ACC e mTORC1, influenzando inoltre l’autofagia e la biogenesi mitocondriale. La deregolazione della segnalazione di AMPKα1 è associata ad alterazioni del sensing dei nutrienti e delle risposte allo stress cellulare, rilevanti per obesità, diabete di tipo 2, steatosi epatica, infiammazione e metabolismo tumorale. L’editing del gene Prkaa1 in modelli murini consente studi meccanicistici sul bilancio energetico, sull’attivazione e la polarizzazione delle cellule immunitarie e sul rimodellamento metabolico specifico di tessuto, supportando flussi di lavoro di genomica funzionale nella ricerca di biologia metabolica e oncologica.

AMPK alpha 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Prkaa1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AMPK alpha 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Prkaa1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Prkaa1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AMPK alpha 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Prkaa1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AMPK alpha 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AMPK alpha 1 nelle cellule tumorali con espressione di Prkaa1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.