aggrecan Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400760-ACT

ACAN codifica l’aggrecano, un grande proteoglicano a solfato di condroitina che rappresenta un componente strutturale principale della matrice extracellulare della cartilagine. L’aggrecano interagisce con l’ialuronano e con la proteina di collegamento (link protein) per formare aggregati ad alto peso molecolare che conferiscono pressione osmotica di rigonfiamento e resistenza al carico nella cartilagine articolare, influenzando la meccanotrasduzione dei condrociti e l’omeostasi della matrice. L’espressione e il turnover di ACAN sono strettamente legati all’organizzazione della matrice extracellulare, alla biosintesi dei glicosaminoglicani e al rimodellamento proteolitico mediato da aggrecanasi come i membri della famiglia ADAMTS. Una sintesi di aggrecano deregolata o una sua scissione accelerata è associata a degenerazione cartilaginea e ad alterazioni dello sviluppo scheletrico, rendendo ACAN un gene chiave per lo studio della biologia dei condrociti e del catabolismo della matrice.

aggrecan Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACAN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

aggrecan Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACAN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACAN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di aggrecan. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACAN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da aggrecan nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via aggrecan nelle cellule tumorali con espressione di ACAN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.