ACTA1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400005-ACT

ACTA1 codifica l’α-actina del muscolo scheletrico, un componente fondamentale dei filamenti sottili che polimerizza in F-actina per sostenere l’assemblaggio del sarcomero, la generazione di forza e l’organizzazione del citoscheletro nel muscolo striato. Attraverso interazioni con miosina, tropomiosina e il complesso della troponina, ACTA1 si integra nei processi di contrattilità actomiosinica e di meccanotrasduzione che modellano la struttura e la funzione delle fibre muscolari. Le dinamiche dell’actina dipendenti da ACTA1 influenzano anche l’architettura cellulare e le vie di segnalazione legate alla differenziazione e al mantenimento del muscolo. La disregolazione o la presenza di varianti patogene in ACTA1 è associata a miopatie scheletriche ereditarie caratterizzate da un’alterata organizzazione dei filamenti e da una performance contrattile modificata.

ACTA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACTA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ACTA1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACTA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACTA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ACTA1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACTA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ACTA1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ACTA1 nelle cellule tumorali con espressione di ACTA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.