γ1-Adaptin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403986-ACT

AP1G1 codifica la subunità γ1-adattina umana del complesso proteico adattatore 1 (AP-1), un componente centrale del rivestimento che seleziona il carico e promuove la formazione di vescicole mediata dalla clatrina a livello della rete trans-Golgi e degli endosomi. Riconoscendo i motivi di smistamento sulle proteine transmembrana, la γ1-adattina contribuisce a coordinare il riciclo dei recettori, l’indirizzamento ai lisosomi e il traffico di membrana polarizzato, influenzando così la durata della segnalazione e la composizione di membrana. Il traffico dipendente da AP-1 si interfaccia con la maturazione endosomiale e con le vie dell’autofagia-lisosoma, supportando la proteostasi e la secrezione regolata. Alterazioni della funzione del complesso adattatore e delle dinamiche del trasporto vescicolare sono ampiamente rilevanti per la ricerca su fenotipi di neurosviluppo, sul traffico dei recettori nelle cellule immunitarie e sulla deregolazione della segnalazione dei fattori di crescita osservata in molteplici contesti patologici.

γ1-Adaptin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AP1G1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γ1-Adaptin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AP1G1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AP1G1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γ1-Adaptin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AP1G1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γ1-Adaptin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γ1-Adaptin nelle cellule tumorali con espressione di AP1G1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.