β2B Tubulin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400059-ACT

TUBB2B kodiert das humane β2B‑Tubulin, eine in Neuronen angereicherte β‑Tubulin‑Isoform, die mit α‑Tubulin zu Heterodimeren assoziiert und so Mikrotubuli bildet, welche die Zytoskelettarchitektur, den intrazellulären Transport und die Dynamik des mitotischen Spindelapparats unterstützen. Im sich entwickelnden und im reifen Nervensystem trägt β2B‑Tubulin über mikrotubuliabhängige Prozesse sowie durch die Koordination mit Motorproteinen und mikrotubuliassoziierten Proteinen zum Neuritenauswuchs, zur Axonführung und zur neuronalen Migration bei. Die durch die Zusammensetzung der Tubulin‑Isoformen regulierte Mikrotubuli‑Dynamik überschneidet sich mit Signalwegen, die Zellpolarität und Zellteilung steuern, darunter Rho‑GTPase‑Signalgebung und die durch das Zentrosom vermittelte Organisation. Pathogene Varianten oder eine dysregulierte Expression von TUBB2B wurden mit neuroentwicklungsbedingten Störungen in Verbindung gebracht, die durch eine veränderte kortikale Organisation und eine beeinträchtigte neuronale Differenzierung gekennzeichnet sind, was es für mechanistische Studien in neuronalen Modellen relevant macht.

β2B Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUBB2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

β2B Tubulin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUBB2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUBB2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen β2B Tubulin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUBB2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von β2B Tubulin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des β2B Tubulin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUBB2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.