α Enolase Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420178-ACT

Mouse Eno1 codifica l’α-enolasi, un metalloenzima glicolitico che catalizza l’interconversione tra 2-fosfoglicerato e fosfoenolpiruvato, collegando il metabolismo centrale del carbonio all’omeostasi energetica cellulare. Oltre alla glicolisi, l’α-enolasi può influenzare il legame al plasminogeno, le risposte allo stress e funzioni associate all’RNA a seconda del contesto subcellulare, mettendo in relazione lo stato metabolico con la dinamica del citoscheletro e la segnalazione. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di ENO1 sono spesso associate a riprogrammazione metabolica e a microambienti infiammatori, a supporto della sua rilevanza in studi su proliferazione, risposte all’ipossia e modulazione immunitaria in modelli di malattia. Nei sistemi murini, Eno1 è comunemente studiato in vie che regolano l’utilizzo del glucosio, l’equilibrio redox e le risposte adattative allo stress da carenza di nutrienti.

α Enolase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Eno1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

α Enolase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Eno1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Eno1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di α Enolase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Eno1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da α Enolase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via α Enolase nelle cellule tumorali con espressione di Eno1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.