ZUFSP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-415124-ACT

Lo ZUFSP umano codifica un enzima deubiquitinante contenente un dominio a dita di zinco che regola il controllo di qualità delle proteine dipendente dall’ubiquitina, scindendo specifici tipi di legami nelle catene di ubiquitina. Contribuisce alla proteostasi e alla segnalazione in risposta allo stress rimodellando i marcatori di ubiquitina che governano il turnover proteico, le risposte al danno del DNA e l’omeostasi degli organelli. L’attività di ZUFSP interseca le dinamiche del sistema ubiquitina–proteasoma e può influenzare gli output di via controllati dall’ubiquitinazione, inclusi la progressione del ciclo cellulare e i programmi di stabilità del genoma. Un’alterata “editing” dell’ubiquitina è ampiamente implicata nella biologia dei tumori e nella neurodegenerazione, rendendo ZUFSP un nodo utile per studi meccanicistici della segnalazione dell’ubiquitina nelle cellule umane.

ZUFSP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZUFSP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ZUFSP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZUFSP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZUFSP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ZUFSP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZUFSP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ZUFSP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ZUFSP nelle cellule tumorali con espressione di ZUFSP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.