VSTM3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404147-ACT

TIGIT, noto anche come VSTM3, codifica un immunorecettore inibitorio espresso sulle cellule T attivate, sulle cellule T regolatorie e sulle cellule NK, che contribuisce a mantenere l’omeostasi immunitaria. Legandosi ai ligandi della famiglia del recettore del poliovirus, come PVR (CD155) e PVRL2 (CD112), TIGIT modula una segnalazione di tipo ITIM e controbilancia le vie costimolatorie, influenzando citotossicità, produzione di citochine e funzione della sinapsi immunitaria. Alterazioni della segnalazione di TIGIT sono implicate nell’elusione immunitaria e nella disfunzione dell’immunità antitumorale, oltre che in contesti di infiammazione cronica e autoimmunità, rendendolo un nodo chiave nella biologia dei checkpoint immunitari. In quanto recettore di superficie che integra segnali di adesione e inibitori, TIGIT offre un punto d’ingresso meccanicistico per studiare le interazioni recettore–ligando, i programmi trascrizionali dei linfociti esausti e il cross-talk con la segnalazione di CD226/DNAM-1.

VSTM3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TIGIT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VSTM3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TIGIT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TIGIT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VSTM3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TIGIT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VSTM3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VSTM3 nelle cellule tumorali con espressione di TIGIT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.