VCX-C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416596-ACT

VCX3B codifica VCX-C, un membro della famiglia genica VCX/Y legata al cromosoma X, espressa prevalentemente nei tessuti della linea germinale maschile e implicata in programmi trascrizionali associati alla spermatogenesi. Sebbene la sua esatta funzione molecolare non sia ancora completamente definita, si ritiene che VCX-C partecipi a processi regolatori associati alla cromatina e all’RNA che influenzano l’espressione genica durante lo sviluppo delle cellule germinali. La variazione del numero di copie e l’espressione disregolata dei loci della famiglia VCX sul cromosoma X sono state studiate nel contesto dell’infertilità maschile e, più in generale, dell’instabilità genomica legata al cromosoma X. In quanto bersaglio umano di VCX3B, VCX-C rappresenta un nodo utile per studiare la regolazione genica nella linea germinale e la biologia delle famiglie geniche legate all’X.

VCX-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VCX3B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VCX-C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VCX3B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VCX3B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VCX-C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VCX3B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VCX-C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VCX-C nelle cellule tumorali con espressione di VCX3B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.