UBE2D4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405030-ACT

UBE2D4 codifica un enzima umano E2 coniugante dell’ubiquitina che coopera con le ligasi E3 per legare l’ubiquitina alle proteine bersaglio, determinandone stabilità, localizzazione e output di segnalazione. Attraverso il suo ruolo nel sistema ubiquitina–proteasoma, UBE2D4 contribuisce al turnover proteico regolato, che influenza la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno del DNA e la proteostasi in condizioni di stress. Alterazioni delle reti di ubiquitinazione sono associate a una segnalazione meno fedele e all’accumulo di proteine mal ripiegate o anomale, processi spesso implicati nella biologia del cancro e nella neurodegenerazione. In quanto componente E2 con ampia compatibilità con le E3, UBE2D4 è utile per analizzare eventi di ubiquitinazione specifici di via e identificare substrati che controllano nodi regolatori chiave.

UBE2D4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBE2D4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UBE2D4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBE2D4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBE2D4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UBE2D4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBE2D4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UBE2D4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UBE2D4 nelle cellule tumorali con espressione di UBE2D4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.