TRPV4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401432-ACT

TRPV4 codifica un canale ionico TRP meccanosensibile permeabile al Ca2+ che integra stimoli osmotici, termici e meccanici per regolare l’eccitabilità di membrana e la segnalazione intracellulare del calcio. L’attività di TRPV4 si collega a vie a valle che includono la segnalazione dipendente dalla calmodulina, le cascate MAPK e il rimodellamento del citoscheletro, influenzando processi quali la funzione di barriera epiteliale, le risposte endoteliali allo shear stress e la meccanotrasduzione dei condrociti. Nei tessuti umani, TRPV4 contribuisce alla trasduzione sensoriale e all’omeostasi del volume in diversi tipi cellulari. Un’alterazione della segnalazione di TRPV4 è stata associata a quadri fisiopatologici che spaziano dai meccanismi del dolore neuropatico alle displasie scheletriche, fino a disfunzioni polmonari e vascolari, rendendolo un bersaglio utile per lo studio delle reti di segnalazione del Ca2+ dipendenti dallo stimolo.

TRPV4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPV4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPV4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPV4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPV4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPV4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPV4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPV4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPV4 nelle cellule tumorali con espressione di TRPV4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.