TRPV3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417690-ACT

TRPV3 codifica un canale cationico non selettivo sensibile al calore e a sostanze chimiche, appartenente alla famiglia dei recettori potenziali transitori vanilloidi, che regola l’ingresso di Ca2+ in contesti epiteliali e sensoriali. L’attivazione del canale influenza l’eccitabilità di membrana e le vie di segnalazione a valle Ca2+-dipendenti implicate nella differenziazione dei cheratinociti, nell’omeostasi della barriera e nella comunicazione neuro-epiteliale. L’attività di TRPV3 interseca le reti di segnalazione infiammatoria e pruriceptiva attraverso la modulazione della dinamica del calcio intracellulare e delle cascate di messaggeri secondari. Alterazioni dell’espressione o della funzione di TRPV3 sono state associate a fenotipi di disfunzione della barriera cutanea e alla biologia correlata al prurito cronico, sostenendone l’impiego come bersaglio meccanicistico nella ricerca sui percorsi epidermici e sensoriali.

TRPV3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPV3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPV3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPV3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPV3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPV3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPV3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPV3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPV3 nelle cellule tumorali con espressione di TRPV3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.