Tropomyosin β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401580-ACT

TPM2 codifica la tropomiosina beta umana, una proteina a coiled-coil legante l’actina che polimerizza lungo l’actina filamentosa per regolare la stabilità dei filamenti sottili e l’accesso dei motori della miosina all’actina. Modulando la contrattilità actomiosinica, la tropomiosina beta contribuisce all’organizzazione del citoscheletro, alla dinamica dei sarcomeri e delle fibre da stress e alle vie che regolano forma cellulare, migrazione e meccanotrasduzione. L’espressione di TPM2 e l’equilibrio tra isoforme influenzano la specializzazione dei filamenti di actina in tessuti muscolari e non muscolari, collegandolo a processi come la miofibrillogenesi e il rimodellamento del citoscheletro. Alterazioni genetiche di TPM2 sono state associate a miopatie congenite e fenotipi di contrattura, rendendolo un bersaglio rilevante per studiare la regolazione dei filamenti di actina in modelli cellulari pertinenti alla malattia.

Tropomyosin β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TPM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tropomyosin β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TPM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TPM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tropomyosin β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TPM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tropomyosin β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tropomyosin β nelle cellule tumorali con espressione di TPM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.