TRC8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403689-ACT

RNF139 umano codifica TRC8, una proteina di membrana multipasso del reticolo endoplasmatico che funziona come ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo RING e modula il controllo di qualità e il turnover proteico. TRC8 integra i processi di rilevamento degli steroli e di degradazione dipendente dall’ubiquitina, influenzando la degradazione associata al RE (ERAD) e più ampie vie di proteostasi. Attraverso la regolazione dell’ubiquitinazione dei substrati, RNF139 può incidere su programmi cellulari legati al controllo della crescita, alle risposte allo stress e all’omeostasi delle proteine di membrana. Un’alterata attività di RNF139/TRC8 è stata studiata nel contesto di riarrangiamenti genomici e di una deregolazione della segnalazione dell’ubiquitina osservati nella biologia del cancro e nelle transizioni correlate dello stato cellulare.

TRC8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RNF139 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRC8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RNF139 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RNF139, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRC8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RNF139 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRC8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRC8 nelle cellule tumorali con espressione di RNF139 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.