TM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400956-ACT

THBD codifica la trombomodulina (TM), una glicoproteina di superficie delle cellule endoteliali che si lega alla trombina e ne modifica la specificità di substrato, favorendo l’attivazione della proteina C e collegando il controllo della coagulazione alla segnalazione anti-infiammatoria. La TM contribuisce all’omeostasi vascolare modulando le vie mediate dalla trombina attraverso i recettori attivati da proteasi (PAR), limitando la formazione di fibrina e regolando la barriera endoteliale e le risposte di adesione dei leucociti. Alterazioni dell’espressione o della funzione di THBD sono associate a un’emostasi disregolata e a fenotipi vascolari infiammatori, e il gene è spesso studiato in contesti quali la suscettibilità alla trombosi, la coagulopatia associata alla sepsi e la disfunzione endoteliale. In quanto marcatore endoteliale sensibile alla trascrizione, THBD è anche utilizzato come indicatore di stress da taglio, esposizione a citochine e programmi di differenziamento vascolare.

TM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di THBD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus THBD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione THBD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus THBD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TM nelle cellule tumorali con espressione di THBD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.