Thrombin R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400556-ACT

F2R codifica il recettore attivato da proteasi 1 (PAR1), un GPCR a sette domini transmembrana che viene attivato dalla proteolisi mediata dalla trombina per avviare una segnalazione polarizzata tramite proteine G eterotrimeriche. PAR1 si accoppia in modo rilevante alle vie Gαq/11, Gα12/13 e Gαi per regolare la segnalazione della fosfolipasi C, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare, il rimodellamento del citoscheletro guidato da RhoA, le cascate MAPK e programmi trascrizionali che influenzano la funzione di barriera endoteliale, l’attivazione piastrinica e le risposte infiammatorie. In contesti vascolari e stromali, F2R integra i segnali della coagulazione con migrazione e adesione cellulare e con cambiamenti di permeabilità, risultando pertinente per studi su infiammazione associata alla trombosi, aterogenesi e segnalazione nel microambiente tumorale. Una segnalazione di PAR1 deregolata è stata associata a una reattività vascolare aberrante e a fenotipi pro-infiammatori in molteplici modelli di malattia, supportandone l’uso come bersaglio meccanicistico nella ricerca sull’emostasi e sulla biologia vascolare.

Thrombin R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di F2R senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Thrombin R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus F2R nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione F2R, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Thrombin R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus F2R nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Thrombin R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Thrombin R nelle cellule tumorali con espressione di F2R silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.