TFIIH p80 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402231-ACT

ERCC2 codifica l’elicasi p80 del complesso TFIIH umano (XPD), una subunità essenziale del complesso TFIIH che collega lo svolgimento del DNA dipendente dall’ATP all’avvio della trascrizione da parte dell’RNA polimerasi II e alla riparazione per escissione di nucleotidi (NER). Attraverso i suoi ruoli nella riparazione accoppiata alla trascrizione e nella NER dell’intero genoma, TFIIH p80 sostiene la stabilità del genoma consentendo il riconoscimento e la rimozione di lesioni voluminose del DNA, come i fotoprodotti indotti dai raggi UV. ERCC2 influenza inoltre la progressione del ciclo cellulare e la risposta cellulare al danno al DNA tramite il coordinamento, mediato da TFIIH, dei programmi di riparazione e di trascrizione. Varianti patogene di ERCC2 sono associate a disturbi della riparazione del DNA, tra cui xeroderma pigmentoso, tricotiodistrofia e sindrome di Cockayne, rendendo ERCC2 un locus ampiamente utilizzato per lo studio della disfunzione della NER e dell’accoppiamento trascrizione-riparazione.

TFIIH p80 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ERCC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFIIH p80 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ERCC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ERCC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFIIH p80. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ERCC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFIIH p80 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFIIH p80 nelle cellule tumorali con espressione di ERCC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.