TDAG8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420643-ACT

Il gene murino **Gpr65** codifica **TDAG8**, un recettore accoppiato a proteine G sensibile ai protoni che rileva l’acidosi extracellulare e trasduce segnali tramite la produzione di cAMP dipendente da Gαs e i conseguenti programmi trascrizionali a valle. L’attività di TDAG8 influenza l’attivazione delle cellule immunitarie, le risposte citochiniche e le decisioni di sopravvivenza in microambienti acidi, collegando il rilevamento del pH alla segnalazione infiammatoria e alla funzione dei leucociti. Oltre alle vie dei secondi messaggeri tipiche dei GPCR, TDAG8 può intersecare reti di risposta allo stress che modulano la chemiotassi e il rimodellamento tissutale. Una deregolazione della segnalazione Gpr65/TDAG8 è stata associata a meccanismi di malattie immuno-mediate e alle interazioni tumore–sistema immunitario, in cui l’acidosi rappresenta un importante segnale contestuale, sostenendone l’impiego in studi meccanicistici sull’infiammazione e sul sensing del microambiente.

TDAG8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gpr65 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TDAG8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gpr65 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gpr65, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TDAG8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gpr65 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TDAG8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TDAG8 nelle cellule tumorali con espressione di Gpr65 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.