TCF-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423299-ACT

Il gene murino **Tcf7** codifica il fattore di trascrizione **TCF-1**, una proteina di legame al DNA del gruppo ad alta mobilità (HMG) che funge da effettore centrale della segnalazione canonica **Wnt/β-catenina**. TCF-1 coordina programmi di espressione genica che controllano la specificazione delle linee linfocitarie, la differenziazione dei timociti e il mantenimento di stati “stem-like” delle cellule T, con effetti a valle sulla segnalazione delle citochine e sull’adattamento metabolico. In contesti immunitari e dello sviluppo, TCF-1 integra diversi segnali per regolare l’accessibilità della cromatina e le reti trascrizionali che modellano le decisioni sul destino cellulare. Una trascrizione dipendente da TCF-1 deregolata è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi immunitaria e a programmi trascrizionali oncogenici studiati in modelli di neoplasie ematologiche.

TCF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tcf7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TCF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tcf7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tcf7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TCF-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tcf7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TCF-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TCF-1 nelle cellule tumorali con espressione di Tcf7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.