T1R2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402555-ACT

Il gene umano TAS1R2 codifica la subunità del recettore del gusto dolce T1R2, un GPCR di classe C che forma un eterodimero con TAS1R3 per rilevare zuccheri ed edulcoranti. Oltre alla percezione gustativa orale, T1R2 contribuisce al sensing dei nutrienti in tessuti extraorali come intestino e pancreas, influenzando la segnalazione glucosio-dipendente, la secrezione ormonale e l’omeostasi metabolica attraverso vie di secondi messaggeri mediate da GPCR. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di TAS1R2 sono state investigate nel contesto di una disregolazione dell’equilibrio energetico e della gestione del glucosio, incluse associazioni riportate nella ricerca sulle malattie metaboliche. In quanto recettore sensore di nutrienti, T1R2 rappresenta un modello maneggevole per studiare il trafficking recettoriale, l’eterodimerizzazione e le risposte trascrizionali a valle a stimoli glucidici.

T1R2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TAS1R2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

T1R2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TAS1R2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TAS1R2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di T1R2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TAS1R2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da T1R2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via T1R2 nelle cellule tumorali con espressione di TAS1R2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.