Sprouty 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401299-ACT

SPRY1 codifica Sprouty 1, un inibitore intracellulare della segnalazione mediata da recettori tirosin-chinasici (RTK) che fornisce un feedback negativo a valle di FGF e di altri fattori di crescita. Attenuando l’attività della via RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK, Sprouty 1 contribuisce a regolare la proliferazione, la migrazione e la differenziazione cellulari durante lo sviluppo e nell’omeostasi dei tessuti. Alterazioni dell’espressione di SPRY1 o dell’equilibrio della sua segnalazione sono state collegate a risposte ai fattori di crescita deregolate osservate in contesti oncogenici e in modelli di biologia vascolare, renale e dello sviluppo. In quanto modulatore di via, Sprouty 1 è spesso studiato per il suo ruolo nel controllare l’ampiezza e la durata del segnale nei programmi trascrizionali dipendenti da MAPK.

Sprouty 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPRY1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Sprouty 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPRY1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPRY1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Sprouty 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPRY1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Sprouty 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Sprouty 1 nelle cellule tumorali con espressione di SPRY1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.