SPNS2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-432145-ACT

Il gene murino **Spns2** codifica **SPNS2**, un trasportatore di membrana multipasso che esporta la **sfingosina-1-fosfato (S1P)**, stabilendo gradienti extracellulari di S1P che modellano la segnalazione mediata dai recettori della S1P. Controllando la disponibilità di S1P, SPNS2 influenza il traffico dei linfociti, la regolazione della barriera endoteliale, i segnali pro-angiogenici e il reclutamento di cellule infiammatorie all’interno della più ampia rete metabolica degli sfingolipidi. L’alterazione del trasporto di S1P mediato da SPNS2 è stata associata a cambiamenti dell’omeostasi immunitaria e della biologia vascolare, rendendo **Spns2** un nodo utile per studiare l’immunoregolazione, i fenotipi associati all’infiammazione e la segnalazione del microambiente. Nei modelli murini, l’attività di **Spns2** viene comunemente indagata nel contesto del flusso di S1P specifico di tessuto, dell’uscita (egress) delle cellule immunitarie e delle vie di sviluppo vascolare.

SPNS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Spns2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SPNS2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Spns2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Spns2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SPNS2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Spns2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SPNS2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SPNS2 nelle cellule tumorali con espressione di Spns2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.