Smad4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421527-ACT

Smad4 murino codifica un mediatore trascrizionale centrale della segnalazione canonica TGF-β e BMP, formando complessi con gli SMAD regolati dal recettore per controllare programmi di espressione genica che governano le decisioni sul destino cellulare, la differenziazione, il rimodellamento della matrice extracellulare e la modulazione immunitaria. L’attività di Smad4 integra i segnali provenienti dai recettori chinasi serina/treonina fino al nucleo, plasmando risposte trascrizionali dipendenti dal contesto in tessuti epiteliali e mesenchimali. L’alterazione o la disregolazione della segnalazione dipendente da SMAD4 è ampiamente utilizzata come quadro molecolare per studiare i meccanismi di soppressione tumorale, fibrosi, segnalazione infiammatoria e patterning dello sviluppo nei sistemi mammiferi. In modelli murini e saggi basati su cellule, Smad4 rappresenta un nodo maneggevole per analizzare il crosstalk di via con le reti MAPK, WNT e PI3K/AKT.

Smad4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Smad4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smad4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Smad4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Smad4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smad4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Smad4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smad4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smad4 nelle cellule tumorali con espressione di Smad4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.