SLK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406490-ACT

La SLK (STE20-like kinase) umana codifica una chinasi serina/treonina implicata nel rimodellamento del citoscheletro, nel turnover delle adesioni focali e nella regolazione della motilità e della polarità cellulare. SLK partecipa a reti di segnalazione collegate a cascate chinasiche di tipo MAPK e a vie sensibili allo stress, che coordinano la dinamica dell’actina con la progressione del ciclo cellulare e l’apoptosi. Attraverso effetti sulla segnalazione dipendente dall’adesione e sull’architettura tissutale, un’attività alterata di SLK è stata associata a fenotipi rilevanti per l’invasione delle cellule tumorali, l’integrità epiteliale e anomalie dello sviluppo. SLK è quindi spesso studiata in modelli di migrazione, morfogenesi e crosstalk tra vie di segnalazione che collegano segnali meccanici a programmi trascrizionali.

SLK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SLK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SLK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SLK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SLK nelle cellule tumorali con espressione di SLK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.