Slit2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423021-ACT

Il gene murino Slit2 codifica un segnale guida secreto, noto soprattutto per il legame ai recettori Robo e per la regolazione della crescita assonale, della migrazione neuronale e della repulsione della linea mediana durante lo sviluppo. Al di fuori del sistema nervoso, la segnalazione SLIT2–ROBO modula la dinamica del citoscheletro, l’adesione cellulare e la motilità direzionale attraverso le GTPasi della famiglia Rho e le vie a valle di rimodellamento dell’actina. L’attività di Slit2 è stata implicata nel patterning vascolare e nel traffico delle cellule immunitarie, collegandola a processi quali angiogenesi e rimodellamento tissutale. Una segnalazione SLIT2/ROBO deregolata è stata associata, nei modelli di cancro, a cambiamenti nell’invasione e nel comportamento metastatico e a fenotipi neuroevolutivi aberranti, a supporto della sua rilevanza negli studi meccanicistici sulla guida e sulla migrazione.

Slit2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slit2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Slit2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slit2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slit2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Slit2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slit2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Slit2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Slit2 nelle cellule tumorali con espressione di Slit2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.