SETX Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402354-ACT

Il gene umano **SETX** codifica la **senataxina**, un’elicasi DNA/RNA della **superfamiglia 1** che risolve gli ibridi RNA:DNA (R-loop) e supporta la terminazione della trascrizione, la risoluzione dei conflitti tra replicazione e trascrizione e il mantenimento della stabilità del genoma. SETX partecipa alla risposta al danno del DNA, accoppiando l’elaborazione dell’RNA con la riparazione delle lesioni associate alla trascrizione e limitando la ricombinazione aberrante in loci altamente trascritti. L’alterazione della funzione di SETX è collegata a fenotipi neurodegenerativi e neuromuscolari, tra cui l’atassia con aprassia oculomotoria di tipo 2 e la sclerosi laterale amiotrofica giovanile, evidenziandone la rilevanza nel metabolismo dell’RNA e nelle vie di risposta allo stress.

SETX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SETX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SETX Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SETX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SETX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SETX. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SETX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SETX nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SETX nelle cellule tumorali con espressione di SETX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.