SDHD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403276-ACT

Il gene umano **SDHD** codifica la piccola subunità integrale di membrana D della succinato deidrogenasi (complesso mitocondriale II), un componente fondamentale che ancora il dominio catalitico della SDH nella membrana mitocondriale interna e supporta il trasferimento di elettroni dal succinato all’ubichinone. Collegando il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) alla catena respiratoria, SDHD contribuisce alla fosforilazione ossidativa, all’equilibrio redox cellulare e all’omeostasi dei metaboliti, inclusa la regolazione dei livelli di succinato. L’alterazione o la deregolazione dell’espressione di SDHD può favorire disfunzione mitocondriale e accumulo di succinato, rimodellando la segnalazione attraverso vie di risposta allo stress e di sensing dell’ossigeno, come i programmi trascrizionali correlati a HIF. SDHD è fortemente rilevante dal punto di vista patologico nella biologia dei tumori con deficit di SDH e nella disregolazione del metabolismo mitocondriale, rendendolo un bersaglio chiave per studiare le relazioni tra genotipo e metabolismo.

SDHD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SDHD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SDHD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SDHD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SDHD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SDHD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SDHD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SDHD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SDHD nelle cellule tumorali con espressione di SDHD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.