SASH1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403567-ACT

SASH1 (SAM and SH3 domain containing 1) codifica una proteina citoplasmatica di tipo scaffold/adattatore implicata nell’organizzazione di complessi di trasduzione del segnale a valle di recettori e di stimoli di stress. Nelle cellule umane, SASH1 è stata collegata alla regolazione della dinamica del citoscheletro, dell’adesione cellulare, della migrazione e di processi associati alla barriera endoteliale, in linea con ruoli nel controllo della proliferazione e dell’architettura tissutale. Un’alterata espressione di SASH1 e variazioni genetiche sono state riportate in molteplici contesti patologici, inclusi la biologia tumorale e fenotipi vascolari o pigmentari, rendendola un nodo utile per studiare output di segnalazione dipendenti dal contesto. Queste funzioni collocano SASH1 come bersaglio di ricerca per analizzare le vie che accoppiano la segnalazione extracellulare a programmi trascrizionali e alla motilità cellulare.

SASH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SASH1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SASH1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SASH1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SASH1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SASH1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SASH1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SASH1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SASH1 nelle cellule tumorali con espressione di SASH1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.