RNase III Drosha Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401639-ACT

DROSHA codifica l’endonucleasi RNasi III Drosha, componente centrale del complesso nucleare Microprocessor che avvia la biogenesi canonica dei microRNA tagliando i trascritti primari di miRNA in miRNA precursori. Grazie alla cooperazione con DGCR8 e alla successiva elaborazione da parte di DICER, Drosha regola programmi di silenziamento genico post-trascrizionale che modellano il controllo del ciclo cellulare, la differenziazione, le risposte allo stress e la segnalazione innata. L’alterazione della maturazione dei miRNA dipendente da DROSHA è stata associata a un’ampia disregolazione del trascrittoma e a modifiche delle vie del danno al DNA e dell’apoptosi. Un’attività o un’espressione aberrante di Drosha è associata a fenotipi molecolari osservati in diversi contesti di cancro e di disturbi dello sviluppo, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico per lo studio delle reti di RNA non codificanti.

RNase III Drosha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DROSHA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNase III Drosha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DROSHA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DROSHA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNase III Drosha. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DROSHA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNase III Drosha nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNase III Drosha nelle cellule tumorali con espressione di DROSHA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.