RIP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400377-ACT

RIPK1 (RIP) umano codifica una chinasi serina/treonina che agisce come regolatore centrale della segnalazione dei recettori del TNF e dei recettori di riconoscimento dei pattern, integrando segnali che determinano la trascrizione infiammatoria, l’apoptosi o la necroptosi. Attraverso funzioni di scaffold e catalitiche, RIPK1 coordina l’assemblaggio di complessi prossimali al recettore e interagisce con la segnalazione NF-κB e MAPK, nonché con l’esecuzione della necroptosi mediata da RIPK3–MLKL. La sua attività influenza la produzione di citochine, le risposte allo stress cellulare e l’omeostasi dell’immunità innata, rendendolo un nodo frequentemente studiato nei processi infiammatori e nella disregolazione immunitaria. La segnalazione di RIPK1 alterata è stata implicata in contesti quali le malattie infiammatorie croniche, la neuroinfiammazione e la segnalazione associata ai tumori, a supporto di studi meccanicistici sulla morte cellulare e sulle vie infiammatorie.

RIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RIPK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RIPK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RIPK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RIPK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIP nelle cellule tumorali con espressione di RIPK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.