RILP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402680-ACT

RILP (Rab-interacting lysosomal protein) è un effettore chiave di Rab7 che coordina il posizionamento, la maturazione e il traffico del carico di endosomi tardivi e lisosomi lungo i microtubuli. Collegando le membrane positive per Rab7 al complesso motorio dyneina–dynactina e partecipando agli eventi di fusione endosoma–lisosoma, RILP influenza la downregolazione dei recettori, la degradazione lisosomiale e il flusso autofagico. Queste funzioni collocano RILP al centro dell’omeostasi endolisosomiale e delle vie di traffico di membrana che plasmano l’output di segnalazione e la proteostasi. La disregolazione del trasporto dipendente dall’asse Rab7–RILP è stata associata a risposte cellulari allo stress e a fenotipi rilevanti per la neurodegenerazione, la biologia delle infezioni e l’adattamento delle cellule tumorali a una funzione lisosomiale alterata.

RILP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RILP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RILP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RILP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RILP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RILP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RILP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RILP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RILP nelle cellule tumorali con espressione di RILP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.