R2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400624-ACT

L’RRM2 umano codifica la subunità R2 della ribonucleotide reduttasi, un enzima essenziale che catalizza la conversione dei ribonucleotidi in desossiribonucleotidi necessari per la replicazione e la riparazione del DNA. R2 fornisce il cofattore diferrico con radicale tirosilico che sostiene il turnover catalitico, collegando così il metabolismo dei nucleotidi alla progressione della fase S e al mantenimento del genoma. L’espressione di RRM2 è strettamente regolata dalle vie del ciclo cellulare e dalla risposta al danno al DNA, e la sua disregolazione è frequentemente associata a fenotipi proliferativi e stress replicativo. Le alterazioni dell’attività di RRM2 sono state studiate in ambiti quali la biologia tumorale, le risposte antivirali e i meccanismi che modulano l’equilibrio dei pool di dNTP e la mutagenesi.

R2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RRM2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

R2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RRM2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RRM2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di R2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RRM2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da R2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via R2 nelle cellule tumorali con espressione di RRM2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.