PP4R2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407439-ACT

PPP4R2 codifica la subunità regolatoria 2 della fosfatasi proteica 4 (PP4R2), un componente di un complesso fosfatasico serina/treonina che contribuisce a indirizzare l’attività catalitica di PP4 verso specifici substrati e processi subcellulari. I complessi di PP4 associati a PP4R2 partecipano alla progressione del ciclo cellulare, alla regolazione del centrosoma e del fuso mitotico e alla segnalazione della risposta al danno al DNA attraverso eventi controllati di defosforilazione che modulano l’attivazione dei checkpoint e i fattori di riparazione associati alla cromatina. Influenzando la dinamica della fosforilazione, PPP4R2 può modulare vie di risposta allo stress e programmi trascrizionali collegati alla stabilità del genoma. Una segnalazione fosfatasica deregolata e un controllo compromesso delle vie di riparazione del DNA sono caratteristiche ricorrenti della biologia dei tumori e di altri disordini proliferativi, rendendo PPP4R2 rilevante per studi meccanicistici della regolazione dipendente dalla fosforilazione.

PP4R2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PPP4R2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PP4R2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PPP4R2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PPP4R2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PP4R2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PPP4R2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PP4R2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PP4R2 nelle cellule tumorali con espressione di PPP4R2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.