PLU-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403771-ACT

KDM5B codifica PLU-1 (JARID1B), una demetilasi delle lisine istoniche contenente un dominio Jumonji C (JmjC) che rimuove preferenzialmente i segni H3K4me3/2, rimodellando così la cromatina associata ai promotori e i programmi trascrizionali. Attraverso interazioni con fattori di trascrizione specifici di linea e complessi di rimodellamento della cromatina, PLU-1 contribuisce alla regolazione della progressione del ciclo cellulare, degli stati di differenziamento e del mantenimento della cromatina legato alla replicazione. Un’attività alterata di KDM5B è stata collegata alla plasticità epigenetica e alla riprogrammazione trascrizionale in molteplici contesti tumorali, rendendolo un bersaglio ampiamente utilizzato per studiare il controllo della proliferazione e dell’identità cellulare dipendente dalla cromatina. Nei modelli cellulari umani, la perturbazione di PLU-1 aiuta a chiarire le vie che collegano la dinamica della metilazione istonica agli esiti dell’espressione genica e alle transizioni fenotipiche.

PLU-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDM5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLU-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDM5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDM5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLU-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDM5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLU-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLU-1 nelle cellule tumorali con espressione di KDM5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.