PLIC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408872-ACT

UBQLN1 codifica ubiquilin-1 (PLIC-1), un adattatore ubiquitina-simile/associato all’ubiquitina che collega i substrati poliubiquitinati al proteasoma 26S e contribuisce a mantenere l’omeostasi proteica. PLIC-1 partecipa alla proteolisi dipendente dall’ubiquitina, alla degradazione associata al reticolo endoplasmatico (ERAD) e a vie di proteostasi responsiva allo stress, influenzando il turnover di proteine mal ripiegate o inclini all’aggregazione. Grazie ai suoi ruoli nel controllo qualità delle proteine e nel traffico intracellulare, UBQLN1 è spesso studiato nel contesto dell’aggregazione proteica neurodegenerativa e dei fenotipi cellulari legati allo stress. Alterazioni della funzione o dell’espressione di UBQLN1 sono state inoltre collegate a una proteostasi deregolata in contesti di segnalazione rilevanti per cancro e infiammazione, a supporto del suo impiego in ricerche focalizzate su vie e meccanismi.

PLIC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBQLN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLIC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBQLN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBQLN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLIC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBQLN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLIC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLIC-1 nelle cellule tumorali con espressione di UBQLN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.