PGCP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411466-ACT

Il gene CPQ umano codifica la carbossipeptidasi del glutammato plasmatico (PGCP), una metalloproteasi secreta che idrolizza i residui di piroglutammato all’estremità N-terminale di peptidi circolanti ed extracellulari, modulando così la stabilità e il turnover dei peptidi. Attraverso il processamento di substrati peptidici bioattivi, PGCP può influenzare reti proteolitiche che si intersecano con la segnalazione nutrizionale, i mediatori dell’infiammazione e l’omeostasi dei peptidi extracellulari. Un’alterata regolazione degli enzimi di processamento peptidico è stata associata a cambiamenti di fenotipi metabolici e immuno-correlati, rendendo CPQ/PGCP un nodo utile per studiare come la proteolisi extracellulare plasmi le risposte cellulari. L’espressione di CPQ e l’attività di PGCP sono quindi rilevanti per la ricerca meccanicistica sul metabolismo dei peptidi e sul rimodellamento delle vie di segnalazione in contesti associati a malattia.

PGCP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CPQ senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PGCP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CPQ nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CPQ, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PGCP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CPQ nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PGCP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PGCP nelle cellule tumorali con espressione di CPQ silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.