Plásmido CRISPR de Activación (h) PASK: sc-416953-ACT

La quinasa de proteínas serina/treonina que contiene el dominio Per-Arnt-Sim (PAS) (PASK) actúa como una quinasa sensora de nutrientes y energía que vincula señales metabólicas con la expresión génica y las decisiones sobre el destino celular. En células humanas, PASK integra señales relacionadas con la disponibilidad de glucosa y la función mitocondrial, y modula programas transcripcionales aguas abajo implicados en el metabolismo de carbohidratos y lípidos, incluidas vías conectadas con la diferenciación endocrina pancreática y procesos sensibles a la insulina. La actividad de PASK se ha estudiado en el contexto de redes de señalización adyacentes a AMPK y mTOR, donde puede influir en el equilibrio anabólico–catabólico y en respuestas adaptativas al estrés. La desregulación de la expresión o de la señalización de PASK se ha asociado con fenotipos metabólicos relevantes para la investigación en diabetes y obesidad, y también se ha explorado por sus funciones más amplias en la proliferación y la adaptación celular.

PASK El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PASK sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PASK El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PASK en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PASK, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PASK. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PASK y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PASK en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PASK en células tumorales con expresión de PASK silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.