parvalbumin α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401364-ACT

PVALB codifica la parvalbumina alfa, una proteina legante il calcio ad alta affinità con motivo EF-hand, che modula la dinamica intracellulare di Ca²⁺ accelerando il buffering e il ritorno ai livelli basali di Ca²⁺ nelle cellule eccitabili. Nel sistema nervoso, la parvalbumina è un marcatore degli interneuroni GABAergici a scarica rapida e favorisce un timing preciso dei potenziali d’azione e le oscillazioni di rete, influenzando il rilascio di neurotrasmettitori Ca²⁺-dipendente e l’integrazione sinaptica. Al di fuori dei circuiti neurali, il buffering del calcio mediato dalla parvalbumina contribuisce alla cinetica contrazione–rilassamento nel muscolo e in altri processi cellulari regolati dal Ca²⁺. Alterazioni dell’espressione di PVALB e della funzione degli interneuroni parvalbumina-positivi sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, rendendo la regolazione di PVALB rilevante per studi sull’eccitabilità dei circuiti e sulla segnalazione calcio-dipendente.

parvalbumin α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PVALB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

parvalbumin α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PVALB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PVALB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di parvalbumin α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PVALB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da parvalbumin α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via parvalbumin α nelle cellule tumorali con espressione di PVALB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.