PAcP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405118-ACT

L’ACPP umano codifica la fosfatasi acida prostatica (PAcP), una fosfomonoesterasi secreta e intracellulare che modula la segnalazione dipendente dal fosfato e i programmi di differenziamento cellulare. Nell’epitelio prostatico, la PAcP è stata associata alla regolazione degli stati di fosforilazione della tirosina e delle vie a valle che influenzano la trascrizione androgeno-responsiva e il controllo della crescita. L’alterazione dell’espressione e dell’attività di ACPP/PAcP è frequentemente studiata nel contesto della biologia prostatica, incluse le variazioni associate alla progressione tumorale e alla plasticità cellulare. In quanto marcatore arricchito a livello tissutale con ruoli funzionali nella segnalazione, ACPP rappresenta un utile punto di partenza per analizzare il rimodellamento delle reti guidato dalle fosfatasi in modelli rilevanti per il cancro.

PAcP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACPP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAcP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACPP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACPP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAcP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACPP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAcP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAcP nelle cellule tumorali con espressione di ACPP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.