PACE4 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-405605-ACT-2

Il gene umano PCSK6 codifica la proprotein convertasi PACE4, una serin-endoproteasi secreta e associata alla matrice extracellulare che attiva diversi precursori proteici clivando residui basici appaiati lungo la via secretoria e alla superficie cellulare. PACE4 contribuisce alla proteostasi e alla segnalazione intercellulare processando fattori di crescita, recettori, metalloproteinasi e componenti della matrice extracellulare, influenzando così vie coinvolte nello sviluppo, nel rimodellamento tissutale e nella migrazione cellulare. Un’attività deregolata di PCSK6/PACE4 è stata associata ad alterazioni delle reti proteolitiche nella progressione tumorale, a tratti cardiovascolari e a contesti di rimodellamento infiammatorio o fibrotico. Strumenti di gene editing e di perturbazione funzionale di PCSK6 consentono studi meccanicistici sulla maturazione dei substrati dipendente dalle convertasi, sul profiling del secretoma e sull’analisi dei circuiti di segnalazione regolati dalle proteasi in modelli cellulari umani.

PACE4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCSK6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PACE4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCSK6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCSK6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PACE4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCSK6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PACE4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PACE4 nelle cellule tumorali con espressione di PCSK6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.