nucleobindin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424686-ACT

Il gene murino Nucb2 codifica la nucleobindina 2, una proteina legante Ca2+ contenente domini EF-hand, che si localizza in compartimenti della via secretoria e partecipa alla secrezione regolata e all’omeostasi cellulare del Ca2+. La nucleobindina 2 è stata collegata alla segnalazione neuroendocrina attraverso la sua processazione in peptidi correlati alla nesfatina-1, con ruoli riportati nel controllo dell’appetito/bilancio energetico e nelle risposte associate allo stress. Nei tessuti periferici, l’alterata espressione di Nucb2 è stata studiata nel contesto della regolazione metabolica, della segnalazione associata all’infiammazione e dell’adattamento cellulare allo stato nutrizionale. Queste caratteristiche rendono Nucb2 un bersaglio utile per analizzare il traffico dipendente dal Ca2+, la biologia dei granuli secretori e il crosstalk neuroendocrino-metabolico in modelli murini.

nucleobindin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nucb2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nucleobindin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nucb2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nucb2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nucleobindin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nucb2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nucleobindin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nucleobindin 2 nelle cellule tumorali con espressione di Nucb2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.