NSF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402258-ACT

NSF (N-ethylmaleimide–sensitive factor) codifica un’ATPasi AAA+ che disassembla i complessi cis-SNARE dopo la fusione di membrana, rigenerando le SNARE per cicli ripetuti di trasporto vescicolare. Questa attività è centrale per il traffico intracellulare, inclusi esocitosi, endocitosi e riciclo delle vescicole sinaptiche, e sostiene la dinamica degli organelli lungo le vie secretorie ed endolisosomiali. Controllando l’efficienza di docking e fusione delle vescicole, NSF influenza la neurotrasmissione, la secrezione e il turnover delle proteine di membrana, processi spesso alterati in disturbi neurologici e in altre patologie in cui proteostasi e traffico risultano compromessi. Una deregolazione del macchinario di fusione vescicolare può modificare la segnalazione cellulare e le risposte allo stress, rendendo NSF un nodo rilevante per studi meccanicistici dei fenotipi legati al traffico di membrana.

NSF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NSF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NSF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NSF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NSF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NSF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NSF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NSF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NSF nelle cellule tumorali con espressione di NSF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.